UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE GUERRERO
UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS
MANUAL DE PRACTICAS DE HEMATOLOGÍA
PRÁCTICA NO. 1
TOMA DE MUESTRA SANGUÍNEA, PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFÉRICA Y TINCIÓN DE ROMANOWSKY
OBJETIVOS:
1. Que el alumno aplique las técnicas estandarizadas más comunes de obtención de muestras de sangre periférica con calidad analítica.
2. Que el alumno realice correctamente extendidos de sangre periférica.
3. Que el alumno conozca y explique el fundamento de la tinción de Romanowsky
INTRODUCCIÓN:
La sangre es una suspensión, en la que aproximadamente el 50% del volumen total de esta corresponde al plasma y el otro 50% de este volumen corresponde a células que se encuentran suspendidas en el plasma.
La obtención de muestras de sangre para los estudios hematológicos requiere de la aplicación de las recomendaciones internacionales de control de calidad, que garanticen la integridad de la muestra.
La punción venosa es uno de los procedimientos más comunes para extraer sangre, ya que posibilita la recolección de sangre venosa para posteriores análisis de laboratorio, se requiere que el paciente esté en condiciones basales (ayuno de 8 horas).
Los sitos para punción venosa son las venas del antebrazo y fosa antecubital; la vena basílica, cefálica y mediana del antebrazo y radial superficial, cubital superficial y mediana de la fosa antecubital.
La obtención de sangre capilar actualmente está limitada a estudios pediátricos, sin embargo anteriormente era el método ideal de extracción de sangre para realizar frotes sanguíneos, ya que inmediatamente después de la punción se recoge en las laminillas para realizar los extendidos, sin que haya necesidad del uso de anticoagulantes que puedan alterar la el volumen de la sangre y morfología celular.
Para realizar los extendidos de sangre periférica, se utiliza sangre venosa anticoagulada generalmente con EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) preferentemente en su forma seca analizados los extendidos antes de que transcurran 2 horas desde la extracción de sangre, o bien sangre capilar directamente de la punción al portaobjetos( es lo ideal). Es recomendable que la sangre anticoagulada sea utilizada inmediatamente para impedir alteraciones morfológicas.
El control de calidad en todas las fases del análisis hematológico es indispensable para lograr confiabilidad de los resultados, por lo que se recomienda obtener muestras de sangre con calidad analítica, siguiendo el protocolo para la toma de muestra que sea apropiada al estudio. La calidad de las extensiones de sangre es indispensable y esto depende del anticoagulante usado, el tipo de sangre (venosa o capilar) con o sin anticoagulante.
La tinción de Wright se fundamenta en la tinción de Romanowsky que consiste en una combinación de azul de metileno y eosina. La acción combinada de estos colorantes produce el efecto de Romanowsky y da una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutrófilos y una coloración rosada a los eritrocitos. Los componentes principales causantes de este efecto son el azur B (un producto de oxidación del azul de metileno) y la eosina Y. La amplia variación en los colores y sombras observadas con la tinción de Romanowsky permiten distinciones sutiles de las características celulares.
La naturaleza ácida o básica de las estructuras celulares determina su avidez por los componentes del colorante policromático de Wright; es así como los ácidos nucleicos se tiñen con azul B que es el básico y la hemoglobina con la eosina Y que es ácida. Otras estructuras se tiñen por una combinación de ambos y se denominan neutrófilas.
MATERIAL:
1 gradilla
Tubos de ensaye DE 13 X 100 mm con anticoagulante EDTA ( 3 por equipo)
1Pipeta automática de 10L 5 puntas amarillas
Jeringas o dispositivos para extracción de sangre con tubos al vacío
Torundas
Torniquete o ligadura de 25 a 30 cm de largo
Alcohol al 70%
Lancetas estériles
Papel absorbente suave
Etiquetas para identificar al paciente
Contenedor de objetos punzo cortantes
Puente para tinción
Jabón de tocador para lavarse las manos
Toallas de papel
Franela o esponja
Lápiz graso o crayola
Reactivos:
EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)
Frasco gotero con colorante de Wright
Metanol absoluto 100 mL
Agua destilada pH 7 una piceta por equipo
Amortiguador de fosfatos pH 6.4 100 mL (1 gotero)
Solución de hipoclorito al 5% para desinfección de mesas de trabajo.
Material biológico:
Muestras de sangre anticoagulada con EDTA o sangre capilar
RECOMENDACIONES DE SEGURIDAD:
1.- ponerse la bata y despejar el área de trabajo dejando sobre la mesa solo el material que va a utilizar en la práctica.
2.- desinfectar la mesa de trabajo con hipoclorito de sodio al 5% (cloro de uso doméstico).
3.-seguir las recomendaciones universales para disminuir los riesgos al exponerse a productos biológicos potencialmente contaminados, en la práctica clínica. Debido a que todos los pacientes pueden ser potenciales portadores de patologías que se transmiten por la vía parenteral, sin tener un diagnóstico objetivable, LAS PRECAUCIONES UNIVERSALES deben aplicarse en la práctica de la atención de cualquier paciente en todo momento y en cualquier ámbito de la atención de salud, siendo esto lo que les confiere el carácter de Universales.
a) Uso de gafas o tapabocas con visera durante la recolección de muestras con riesgo de salpicaduras procedentes de pacientes de con enfermedades infectocontagiosas.
b) No re-enfundar agujas y desecharlas en el recipiente adecuado (o desechar la aguja y la jeringa en un galón destinado para tal fin, evitando la manipulación.
c) Preservar la técnica aséptica en la obtención de muestras mediante procedimientos invasivos (venopunción periférica, catéter central etc.)
PROCEDIMIENTO PARA PUNCIÓN VENOSA
1.- Lavarse las manos perfectamente con agua y jabón.
2- Verificar que cada muestra esté acompañada de información que incluya; nombre y apellidos del paciente, edad, sexo, procedencia cuando proviene de otra institución, tipo de muestra, diagnóstico presuntivo, fecha y hora de toma de la muestra, medicación (si el paciente está recibiendo tratamiento), tipo de estudio a realizar. Por lo que las muestras de los alumnos deben estar acompañadas de esta información.
3.- Preguntar al paciente si guardó el ayuno adecuado (en caso necesario), preguntar la hora de la última ingesta.
4- Tranquilizar al paciente e informarle del procedimiento al que será sometido.
5.-Colocar adecuadamente al paciente; sentado paralelamente a la mesa de trabajo, apoyará el brazo sobre la mesa colocando una almohadilla bajo el codo y la palma de la mano hacia
.arriba.
6.-Verificar el material a utilizar; tubos, anticoagulante, jeringas torniquete, torundas etc.
7.-Pedir al paciente que abra y cierre el puño para palpar mejor las venas.
8.-Seleccionar una avena adecuada para la punción. Evitar tomar la muestra en el brazo donde hay catéter. No extraer sangre de la misma extremidad utilizada para la administración intravenosa de medicamentos, líquidos o transfusiones. Si no existe otro sitio disponible, asegurarse que la punción venosa se localiza por debajo del catéter IV. Evitar las áreas edematosas, paralizadas o el mismo lado de una masectomía, al igual que las infecciones y problemas cutáneos. La punción venosa causa infección, alteraciones circulatorias o retraso en la cicatrización.
9.- Desinfectar el sitio de punción con una torunda con alcohol al 70%, con movimientos en espiral comenzando por el sitio que se puncionará y prosiguiendo hacia fuera, dejar que la zona se seque y no tocar con ningún objeto que no haya sido esterilizado previamente.
10.- Aplicar el torniquete varios centímetros arriba de la zona de punción, este no se dejará más de un minuto.
11.- Fijar firmemente la vena por encima y por debajo del sitio de punción con ayuda de los dedos pulgar y medio o índice y pulgar de la mano izquierda.
12.- Realizar la venopunción;
a) Penetrar a través de la piel con la aguja formando un ángulo de 15º entre el brazo y la aguja con el bisel hacia arriba, seguir la dirección de la vena con la aguja.
b) Introducir la guja con suavidad pero con rapidez para reducir las molestias al paciente.
c) Si se usa jeringa, tirar del émbolo hacia atrás con tensión lenta y uniforme, a medida que la sangre fluye en su interior, este movimiento no debe ser muy rápido ya que se puede bemolizar la sangre o colapsar la vena.
d) Si se utilizan tubos al vacío, en cuanto la aguja haya penetrado la vena, se dirigirá el tubo todo lo posible hacia delante en el dispositivo de sujeción, al mismo tiempo sujetar tenuemente la aguja en su lugar. Se debe permitir que el tubo al vació se llene hasta la marca indicada.
13.-Retirar la ligadura tirando del extremo doblado después de obtener el volumen de sangre deseado.
14.-Colocar un pedazo de algodón seco sobre la parte donde se encuentra oculta la aguja. Sacar la aguja con un movimiento rápido y depositarla en el recipiente de metal con desinfectante.
15.-Pedir al paciente que presione firmemente el algodón durante 3 minutos, con el brazo extendido. No se recomienda que se flexione el brazo a causa del riesgo que se forme un hematoma.
16.-Mezclar por inversión suave la sangre 15 veces (cuando el tubo colector tiene anticoagulante).
17.-Si la hemorragia de la punción continúa durante un tiempo prolongado, eleve el área y aplique una curación con presión. Observe al paciente y verifique si no ha ingerido anticoagulante o ácido acetilsalicílico. Si el paciente se marea o tiende al desmayo, haga que coloque la cabeza entre las rodillas o se acueste y pídale respirar profundamente. Aplique una toalla fría en al cabeza o parte posterior del cuello. En caso que permanezca inconsciente, notifique de inmediato al médico tratante.
18.-Los hematomas se previenen con una técnica adecuada que consiste en evitar que la aguja atraviese la vena, liberar el torniquete antes de extraer la aguja, aplicación de suficiente presión sobre el sitio de la punción y al mantener la extremidad extendida hasta que se detenga la hemorragia.
PROCEDIMIENTO PARA PUNCION CAPILAR:
1.-Si la punción se realizará a un RN éste debe ser inmovilizado
2.-seleccionar el sitio de punción
3.- en adultos el sitio adecuado para la punción capilar es el pulpejo del dedo mediano o anular, cerca del borde, en niños el lóbulo de la oreja, y en RN el talón del pie
4.-Se recomienda el lavado clínico de manos y uso de guantes si es necesario
5.-realizar la asepsia de la zona
6.-introducir la lanceta de 2 a 2.5 mm con un movimiento rápido
7.-presionar para extraer la cantidad necesaria de sangre desechando la primera gota
8.-depositar la muestra en capilar o laminilla.
9.-realizar hemostasis en el sitio de punción y proteger con gasa estéril
10.- verificar confort del RN
11.- si se presenta dificultades durante la punción se recomienda repetirla, sobre todo cuando la muestra es insuficiente y se ha exprimido excesivamente la zona de punción, ya que puede sufrir una hemodilución por el líquido hístico.
PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR LOS EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFÉRICA
1. Desengrasar los cubreobjetos para las extensiones de sangre periférica.
2. Obtener la muestra de sangre con anticoagulante EDTA o sangre capilar.
3. Homogenizar perfectamente la muestra por inversión 15 veces
4. Realizar el frotis por la técnica de los dos portaobjetos que se describe en seguida:
a. Depositar una pequeña gota de sangre (aproximadamente 5 L) en el extremo de un portaobjetos limpio y libre de grasa.
b. Con el borde de otro portaobjetos a 45º, tocar la gota, esperar a que la sangre se distribuya por capilaridad (sin permitir que la sangre toque los extremos del portaobjetos que se desliza) y después deslizar suavemente pero con suficiente rapidez el portaobjetos sobre el otro en sentido longitudinal hasta que la gota quede bien extendida sobre la superficie del primer portaobjetos.
c. El grosor de la extensión sanguínea puede variar según sea el ángulo que se forma entre los dos portaobjetos, si es superior a 45º, la extensión será gruesa y corta; si es inferior a 45º será larga y fina.
d. Dejar secar el frotis de 15 a 20 minutos a temperatura ambiente en posición horizontal.
TINCIÓN DE WRIGHT
1. Colocar los extendidos en un plano horizontal en el puente para tinción con la extensión de sangre hacia arriba
2. Cubrir toda la superficie de la preparación con Wright. Esperar de 3ª 5 minutos (el tiempo óptimo es determinado por ensayo y error).
3. Agregar un volumen igual de solución amortiguadora (pH 6.4) o en su defecto agua de destilada de pH 7 con resultados igualmente buenos. La cantidad de agua o buffer debe ser suficiente para cubrir la lámina completamente, pero no en exceso.
4. Soplar suavemente el extendido para mezclar hasta obtener una película uniforme de apariencia metálica - verdosa. Esperar de 7 a 15 minutos (dependiendo de la maduración del colorante).
5. Lavar el colorante con agua corriente manteniendo los extendidos en posición horizontal. El lavado debe ser rápido (5 - 30 segundos) para evitar la precipitación del colorante sobre la superficie del extendido.
6. Dejar secar al aire.
7. Quitar con una gasa o algodón humedecido en alcohol, el colorante que queda adherido al dorso del portaobjetos, teniendo cuidado de que el alcohol no tenga contacto con la superficie coloreada.
TINCIÓN DE GIEMSA
1. Después de realizar el extendido de sangre periférica, dejar secar el frotis de 15 a 20 minutos
2. Fijar el extendido con 3 a 4 gotas de metanol absoluto por 3 minutos
3. Preparar en un tubo de ensayo una solución con una proporción de 1:9 con Giemsa y tampón PBS (1ml Giemsa y 9 ml PBS).
4. Cubrir la preparación o sumergirla en la solución preparada durante 10 minutos.
5. Lavar el portaobjetos con agua destilada.
6. Dejar secar.
7. Aplicar el cubreobjetos cuando sea necesario) sobre la preparación.
8. Listo para su observación en el microscopio.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es el objeto de usar un anticoagulante en los estudios hematológicos?
2. Explica en qué proporción se usa el EDTA y porqué inhibe la coagulación sanguínea
3. ¿Cuáles son las propiedades de tinción de los colorantes de Romanowsky?
4. ¿Cuál es la función del metanol en la tinción de Giemsa?
5. ¿Cuáles pueden ser las causas de error en la tinción de extendidos sanguíneos?
6. ¿Cuál es la función del Buffer en la tinción de Wright?
